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洛克菲勒大學開發(fā)新型RNA測序方法,揭示復雜細菌轉(zhuǎn)錄組信息

發(fā)布日期:2019-7-16瀏覽次數(shù):768

2019年7月17日,位于美國紐約的洛克菲勒大學劉詩欣實驗室(第一作者為鞠湘武博士)在Nature Microbiology發(fā)表文章Full-length RNA profiling reveals pervasive bidirectional transcription terminators in bacteria,報道了他們研究的一種新的RNA測序方法,5 和3 末端連同測序(simultaneous 5 and 3 end sequencing, SEnd-seq)。


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這種方法通過將RNA末端標記后,逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA,然后將cDNA進行環(huán)化,使得cDNA的兩個末端連接在一起。隨后將環(huán)化的cDNA 打斷后,將同時包含RNA 5’端和3’端的片段進行富集并制備成測序文庫,在Illumina 平臺如Next-seq 500進行測序。通過相應的生物信息學分析可以精確地還原RNA的相應末端信息。由于在細菌中內(nèi)含子并不常見,因些可以根據(jù)兩處末端信息推斷出每個RNA分子的完整序列信息。


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圖1:SEnd-seq RNA測序流程


該論文使用了一種高通讀性的II型內(nèi)含子成熟酶,來盡可能地將長度各異、包含各種復雜二級結(jié)構(gòu)的全長RNA完整地逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;并通過優(yōu)化反應條件,使得TS2126連接酶能高效地將不同長度的cDNA環(huán)化。文章在隨后一系列的質(zhì)量控制分析中,顯示SEnd-seq并沒有引起明顯的長度或者末端序列偏差,也幾乎沒有檢測到不同cDNA的線性連接,而且得到基因表達水平同普通RNA測序結(jié)果高度相關(guān)。


因此通過SEnd-seq RNA測序方法,該文作者繪制出精確到單個核甘酸的高分辨率大腸桿菌轉(zhuǎn)錄組圖譜。同時結(jié)合相應方法,SEnd-seq可以在大腸桿菌中檢測出比以前更多的轉(zhuǎn)錄起始位點 (TSS) 和轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄終止位點(TTS),并成功注釋大部分轉(zhuǎn)錄終止位點類型如固有終止子(Intrinsic terminator)和Rho蛋白依賴的終止子(Rho-dependent terminator)。而且SEnd-seq方法可以非常直觀地顯示轉(zhuǎn)錄組操縱子結(jié)構(gòu),反義RNA分布等多種信息。


除此之外,他們還發(fā)現(xiàn)很多兩個轉(zhuǎn)錄會聚方向的RNA轉(zhuǎn)錄物經(jīng)常會出現(xiàn)3’末端重疊,從而形成雙向轉(zhuǎn)錄終止子(Bidirectional terminator)。而這兩個轉(zhuǎn)錄本可能是由一對轉(zhuǎn)錄相反方向的基因或基因和反義編碼RNA之間組成。但大部分雙向轉(zhuǎn)錄終止子并不是兩個轉(zhuǎn)錄終止子的簡單重疊,提示其它的機制可能在發(fā)揮作用。通過體外和體內(nèi)的實驗進一步證明,兩個會聚行進方向的RNA 聚合酶在雙向轉(zhuǎn)錄終止子附近的碰撞會引起很高的轉(zhuǎn)錄終止效率,比僅僅單一方向的轉(zhuǎn)錄終止效率要高得多。這一發(fā)現(xiàn)進一步將基因轉(zhuǎn)錄排列方向同轉(zhuǎn)錄功能及產(chǎn)物聯(lián)系起來。


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圖2:會聚行進方向的RNA 聚合酶碰撞引起轉(zhuǎn)錄終止示意圖


以上結(jié)果表明,SEnd-seq是一種功能強大的測序方法。而且一對測序序列可以對應一條RNA分子,因此很容易得到很深的測序深度并節(jié)省測序費用。綜上, SEnd-seq完全可以進一步被廣泛地應用于病原細菌轉(zhuǎn)錄組和亞轉(zhuǎn)錄組等方向的研究。


洛克菲勒大學開發(fā)新型RNA測序方法,揭示復雜細菌轉(zhuǎn)錄組信息


研究背景


RNA 不僅起到傳遞遺傳信息、翻譯蛋白的作用,在細胞內(nèi)還發(fā)揮非常廣泛和關(guān)鍵的調(diào)節(jié)功能, 如小RNA和非編碼RNA等。而RNA功能主要是由其核苷酸序列決定的,特別是5 和3 末端序列對其功能至關(guān)重要。在細菌體內(nèi),RNA 的轉(zhuǎn)錄、翻譯和降解常常同時進行,每個RNA分子的5 和3 末端動態(tài)變化是體內(nèi)一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的產(chǎn)物。因此,測定所有RNA分子的全長序列可以更好地了解細胞功能、基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡,特別是同RNA 有關(guān)機制的相互作用。


新一代高通量RNA測序是用于分析轉(zhuǎn)錄組學革命性的工具。基于Illumina 平臺的高通量測序可以輕易地得到大量的測序短序列,但通常需要將RNA進行打斷,從而失去了RNA的完整序列信息;而基于PacBio平臺的長序列測序可以得到RNA完整序列信息,但目前仍不能滿足轉(zhuǎn)錄組研究的準確性、高深度和高可靠性的要求。因此一種能夠結(jié)合兩者優(yōu)勢的方法必將深受歡迎。


關(guān)于洛克菲勒大學


洛克菲勒大學(Rockefeller University)是一所世界著名的生物醫(yī)學教育研究中心,位于美國紐約,由美國石油大王洛克菲勒捐資建立。成立于1901年的洛克菲勒醫(yī)學研究所,在其82個獨立的實驗室中, 大學為科學家們提供一個獨特的協(xié)作環(huán)境。洛克菲勒醫(yī)學院引導患者導向?qū)W習,是全國唯一的完全用于臨床研究的私人醫(yī)療設施機構(gòu)。洛克菲勒大學在生理學或醫(yī)學、化學領域擁有36位諾貝爾獎獲得者(校友及教職工),是世界上在生物醫(yī)學領域擁有諾貝爾獎最多的機構(gòu)。




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