2019年7月17日，位于美國(guó)紐約的洛克菲勒大學(xué)劉詩(shī)欣實(shí)驗(yàn)室（第一作者為鞠湘武博士）在Nature Microbiology發(fā)表文章Full-length RNA profiling reveals pervasive bidirectional transcription terminators in bacteria，報(bào)道了他們研究的一種新的RNA測(cè)序方法，5 和3 末端連同測(cè)序（simultaneous 5 and 3 end sequencing, SEnd-seq）。

這種方法通過(guò)將RNA末端標(biāo)記后，逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，然后將cDNA進(jìn)行環(huán)化，使得cDNA的兩個(gè)末端連接在一起。隨后將環(huán)化的cDNA 打斷后，將同時(shí)包含RNA 5’端和3’端的片段進(jìn)行富集并制備成測(cè)序文庫(kù)，在Illumina 平臺(tái)如Next-seq 500進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)相應(yīng)的生物信息學(xué)分析可以精確地還原RNA的相應(yīng)末端信息。由于在細(xì)菌中內(nèi)含子并不常見(jiàn)，因些可以根據(jù)兩處末端信息推斷出每個(gè)RNA分子的完整序列信息。

圖1：SEnd-seq RNA測(cè)序流程

該論文使用了一種高通讀性的II型內(nèi)含子成熟酶，來(lái)盡可能地將長(zhǎng)度各異、包含各種復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的全長(zhǎng)RNA完整地逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；并通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，使得TS2126連接酶能高效地將不同長(zhǎng)度的cDNA環(huán)化。文章在隨后一系列的質(zhì)量控制分析中，顯示SEnd-seq并沒(méi)有引起明顯的長(zhǎng)度或者末端序列偏差，也幾乎沒(méi)有檢測(cè)到不同cDNA的線性連接，而且得到基因表達(dá)水平同普通RNA測(cè)序結(jié)果高度相關(guān)。

因此通過(guò)SEnd-seq RNA測(cè)序方法，該文作者繪制出精確到單個(gè)核甘酸的高分辨率大腸桿菌轉(zhuǎn)錄組圖譜。同時(shí)結(jié)合相應(yīng)方法，SEnd-seq可以在大腸桿菌中檢測(cè)出比以前更多的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) （TSS） 和轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（TTS），并成功注釋大部分轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)類(lèi)型如固有終止子（Intrinsic terminator）和Rho蛋白依賴(lài)的終止子（Rho-dependent terminator）。而且SEnd-seq方法可以非常直觀地顯示轉(zhuǎn)錄組操縱子結(jié)構(gòu)，反義RNA分布等多種信息。

除此之外，他們還發(fā)現(xiàn)很多兩個(gè)轉(zhuǎn)錄會(huì)聚方向的RNA轉(zhuǎn)錄物經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)3’末端重疊，從而形成雙向轉(zhuǎn)錄終止子（Bidirectional terminator）。而這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能是由一對(duì)轉(zhuǎn)錄相反方向的基因或基因和反義編碼RNA之間組成。但大部分雙向轉(zhuǎn)錄終止子并不是兩個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子的簡(jiǎn)單重疊，提示其它的機(jī)制可能在發(fā)揮作用。通過(guò)體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明，兩個(gè)會(huì)聚行進(jìn)方向的RNA 聚合酶在雙向轉(zhuǎn)錄終止子附近的碰撞會(huì)引起很高的轉(zhuǎn)錄終止效率，比僅僅單一方向的轉(zhuǎn)錄終止效率要高得多。這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步將基因轉(zhuǎn)錄排列方向同轉(zhuǎn)錄功能及產(chǎn)物聯(lián)系起來(lái)。

圖2：會(huì)聚行進(jìn)方向的RNA 聚合酶碰撞引起轉(zhuǎn)錄終止示意圖

以上結(jié)果表明，SEnd-seq是一種功能強(qiáng)大的測(cè)序方法。而且一對(duì)測(cè)序序列可以對(duì)應(yīng)一條RNA分子，因此很容易得到很深的測(cè)序深度并節(jié)省測(cè)序費(fèi)用。綜上， SEnd-seq完全可以進(jìn)一步被廣泛地應(yīng)用于病原細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組和亞轉(zhuǎn)錄組等方向的研究。

研究背景

RNA 不僅起到傳遞遺傳信息、翻譯蛋白的作用，在細(xì)胞內(nèi)還發(fā)揮非常廣泛和關(guān)鍵的調(diào)節(jié)功能， 如小RNA和非編碼RNA等。而RNA功能主要是由其核苷酸序列決定的，特別是5 和3 末端序列對(duì)其功能至關(guān)重要。在細(xì)菌體內(nèi)，RNA 的轉(zhuǎn)錄、翻譯和降解常常同時(shí)進(jìn)行，每個(gè)RNA分子的5 和3 末端動(dòng)態(tài)變化是體內(nèi)一系列轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的產(chǎn)物。因此，測(cè)定所有RNA分子的全長(zhǎng)序列可以更好地了解細(xì)胞功能、基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，特別是同RNA 有關(guān)機(jī)制的相互作用。

新一代高通量RNA測(cè)序是用于分析轉(zhuǎn)錄組學(xué)革命性的工具?；贗llumina 平臺(tái)的高通量測(cè)序可以輕易地得到大量的測(cè)序短序列，但通常需要將RNA進(jìn)行打斷，從而失去了RNA的完整序列信息；而基于PacBio平臺(tái)的長(zhǎng)序列測(cè)序可以得到RNA完整序列信息，但目前仍不能滿足轉(zhuǎn)錄組研究的準(zhǔn)確性、高深度和高可靠性的要求。因此一種能夠結(jié)合兩者優(yōu)勢(shì)的方法必將深受歡迎。

關(guān)于洛克菲勒大學(xué)

洛克菲勒大學(xué)（Rockefeller University）是一所世界著名的生物醫(yī)學(xué)教育研究中心，位于美國(guó)紐約，由美國(guó)石油大王洛克菲勒捐資建立。成立于1901年的洛克菲勒醫(yī)學(xué)研究所，在其82個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)室中， 大學(xué)為科學(xué)家們提供一個(gè)獨(dú)特的協(xié)作環(huán)境。洛克菲勒醫(yī)學(xué)院引導(dǎo)患者導(dǎo)向?qū)W習(xí)，是全國(guó)唯一的完全用于臨床研究的私人醫(yī)療設(shè)施機(jī)構(gòu)。洛克菲勒大學(xué)在生理學(xué)或醫(yī)學(xué)、化學(xué)領(lǐng)域擁有36位諾貝爾獎(jiǎng)獲得者（校友及教職工），是世界上在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擁有諾貝爾獎(jiǎng)最多的機(jī)構(gòu)。